大学分子生物学上册《分子生物学常用技术》练习题

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本单元考点（6 个）

PCR的基本原理与引物设计琼脂糖凝胶电泳的原理Sanger测序法的原理与应用Southern与Northern杂交RT-PCR与实时定量PCRCRISPR-Cas9基因编辑技术

本单元练习题（26 题）

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1. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，凝胶浓度越高，孔径越小，对DNA分子的分子筛阻力越大。在电场强度和缓冲液条件相同的前提下，同一双链DNA片段（大小相同）在1.0%凝胶中的迁移速率____（填“大于”或“小于”）在1.5%凝胶中的迁移速率；而对于同一种浓度的凝胶，两个不同大小的双链DNA片段中，较小片段的迁移速率____（填“大于”或“小于”）较大片段。综合以上两点，欲较好地分离大小相近的DNA片段，应适当____（填“提高”或“降低”）凝胶浓度。

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2. 某实验室以一段双链DNA为模板进行PCR扩增，反应体系中初始含该模板双链分子1000个，共进行25个循环。假设扩增效率为100%，且每一循环所有双链DNA分子均完整复制一次。（1）理论上第25个循环结束后，反应体系中该目标片段的双链分子总数是多少？（用科学记数法表示）（2）若PCR扩增的特异性主要取决于哪一步骤中的哪种物质与模板的退火配对？请简述其生物学意义。

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3. 琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子在电场中的迁移距离可近似表示为 d = μ×E×t，其中 μ 为该DNA片段在特定凝胶中的迁移率（cm/(V·min)），E 为电场强度（V/cm），t 为电泳时间（min）。某实验中，一双链DNA片段在 5 V/cm 电场强度下电泳 40 min，测得迁移距离为 3 cm。求该DNA片段在此凝胶中的迁移率 μ。

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4. 用Sanger双脱氧链终止法测定一段DNA。已知模板链为 3'-TACGGTAC-5'（8个碱基），测序反应中设四个平行管，分别额外加入少量ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。请回答：(1) 写出新生成的互补测序链序列（注明5'→3'方向）；(2) 在加入ddGTP的反应管中，各终止片段的长度（以核苷酸数表示）分别为多少？(3) 该管中最短终止片段的3'末端是哪种双脱氧核苷酸？

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5. 琼脂糖凝胶电泳中，双链DNA片段的迁移率主要受其分子大小与凝胶孔径的分子筛效应影响。现用同一浓度凝胶、同一电场条件对四个双链DNA片段A、B、C、D进行电泳，已知其碱基对数分别为500 bp、2000 bp、10000 bp、5000 bp。若四个片段的迁移率与碱基对数的负相关关系符合 v∝1/log(N) 的规律，则泳动最快（迁移率最大）的是片段____，泳动最慢的是片段____；若在正常电泳缓冲液（pH约8.0）中，DNA分子由于磷酸基团解离而带____电荷，因此由____极向____极迁移。

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6. 某实验室提取了某哺乳动物基因组DNA和该动物肝脏组织的总RNA，分别进行了Southern杂交和Northern杂交，均使用针对同一基因X外显子2的标记探针。已知该基因X在肝脏细胞中存在一个外显子2的旁系同源拷贝（序列同源性约80%），且该基因在肝脏高表达，在肾脏低表达。请回答：（1）Southern杂交用限制酶酶切基因组DNA后转膜杂交，可用于检测基因X的____（如酶切片段大小、基因拷贝数等基因组水平信息）；（2）若要检测基因X在肝脏与肾脏组织中的表达量差异，应选择____杂交；（3）Northern杂交中，若探针在严谨性较低的条件下使用，可能因旁系同源拷贝mRNA的同源性而出现____条带，导致假阳性。

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7. 某实验室以一段双链DNA为模板进行PCR扩增，反应体系中初始含目的片段双链分子800个，共进行20个循环。已知该反应的扩增效率为80%（即每一循环结束后，双链DNA分子总数变为上一循环结束时的1.8倍），且引物设计正确、无非特异扩增。请计算20个循环结束后体系中目的片段双链分子的理论总数（保留三位有效数字），并根据PCR基本原理说明：引物只能与模板单链的哪一端互补结合、延伸方向是什么？

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8. 琼脂糖凝胶电泳中，除分子大小外，DNA的构象也会影响其迁移率。在凝胶孔径与电场条件相同、碱基对数相同的前提下，超螺旋DNA（结构致密）、线形双链DNA和开环（缺刻）DNA（结构松散）三者迁移快慢的顺序通常是：A. 超螺旋＞线形＞开环　B. 开环＞线形＞超螺旋　C. 线形＞超螺旋＞开环　D. 三者迁移率完全相同

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9. 某实验室用RT-qPCR比较药物处理组与对照组中基因Z的表达水平。总RNA经逆转录后进行实时荧光定量PCR，目的基因与内参基因的扩增效率均为90%。测得对照组中目的基因与内参基因的Ct差值（ΔCt）为4，药物处理组中该差值为9。据此判断：药物处理后基因Z的表达水平变为对照组的1/(1.9)^5倍，即约为对照组的____%（保留两位小数），说明药物处理后该基因表达被下调约____倍（保留一位小数）。

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10. 在Sanger双脱氧链终止测序法中，反应体系内加入的ddNTP与dNTP的区别在于其哪一位置缺少羟基，从而导致DNA链延伸终止？A. 2′-脱氧核糖的3′位缺少羟基 B. 核糖的5′位缺少羟基 C. 碱基上缺少羟基 D. 磷酸基团上缺少羟基

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11. 琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在电场作用下的迁移行为主要取决于凝胶的分子筛效应。下列关于其原理的叙述，正确的是：A. DNA分子在碱性电泳缓冲液中带正电荷，故由正极向负极迁移 B. 迁移速率主要与DNA的分子大小和凝胶浓度有关，分子越小迁移越快 C. 线状双链DNA的迁移速率与其碱基组成（GC含量）密切相关，是决定迁移快慢的首要因素 D. 溴化乙锭嵌入DNA后使其带负电荷增加，是DNA能向负极迁移的原因

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12. Sanger双脱氧链终止测序法中，ddNTP掺入延伸中的DNA链后，由于其脱氧核糖的____位缺少羟基，无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键，导致链延伸终止。

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13. 检测某基因表达水平时，先以mRNA为模板经____酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，此方法称为RT-PCR；若在扩增过程中实时监测荧光信号，以荧光强度达到可检测阈值时的循环数（即____值）作为定量指标，则称为实时定量PCR。与常规RT-PCR相比，实时定量PCR可对起始模板量进行____（填“定性”或“定量”）分析。

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14. 某PCR反应体系中，经30个循环扩增后，理论上目的DNA片段的拷贝数是初始模板拷贝数的多少倍？若初始模板为50个拷贝，循环30次后理论上可得多少个目的DNA拷贝？

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15. 琼脂糖凝胶电泳中，双链DNA片段的相对迁移率可近似表示为 v = k/log(N)，其中N为片段碱基对数，k为只与电场强度、缓冲液和凝胶浓度有关的比例常数。在电场强度、缓冲液和凝胶浓度完全相同的条件下，比较300 bp与1000 bp两个双链DNA线性片段。（1）求两者迁移率之比 v₃₀₀/v₁₀₀₀（结果保留两位小数）；（2）若300 bp片段泳动2.0 cm需用时12 min，估算1000 bp片段泳动相同距离所需时间（单位：min，保留一位小数）。已知 lg300≈2.477，lg1000=3。

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16. 在Sanger双脱氧链终止测序法中，DNA聚合酶延伸引物时，若体系中掺入ddNTP，由于其3′位缺少羟基，无法与后续dNTP形成____键，链延伸随即终止；通过高分辨率变性凝胶电泳按____长短分开各终止片段，再从短到长读取即可读出序列。

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17. 下列关于PCR基本原理与引物设计的叙述，正确的是（　） A. 引物是与模板单链互补的一小段寡核苷酸，PCR需一对引物分别与两条模板链3'端一侧序列互补结合，引导Taq酶从引物3'端延伸 B. PCR每个循环依次经历变性、复性、延伸三步，引物在延伸阶段与模板结合 C. 设计时引物越长越好，最好超过50个核苷酸以保证特异性 D. 引物可与目的DNA序列任意区段随机结合，无需考虑其与模板的互补性

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18. 琼脂糖凝胶电泳是分离DNA片段的常用技术。下列关于其分离原理的叙述，正确的是：A. DNA在pH约8.0的电泳缓冲液中，磷酸基团解离带负电荷，在外加电场作用下向正极迁移；B. DNA片段的迁移速率与其分子量大小成正比，片段越大迁移越快；C. 琼脂糖凝胶的分离作用主要依靠其吸附作用，与凝胶孔径无关；D. 溴化乙锭嵌入DNA后使其带正电荷，从而改变迁移方向。

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19. 某基因片段双链中，一条链的5'端起始序列为 5'-ACGTTACG-3'。现需设计一对PCR引物扩增包含该区域的双链DNA片段，且引物长度均为8 bp。下列关于正向引物与反向引物序列的表述，正确的是：A. 正向引物为 5'-ACGTTACG-3'，反向引物为其下游互补链区段的相同序列 B. 正向引物与该链序列相同（5'-ACGTTACG-3'），反向引物应与另一条链的对应区段序列相同，即 5'-CGTAACGT-3' C. 正向引物为 5'-CGTAACGT-3'，反向引物为 5'-ACGTTACG-3' D. 两条引物序列必须完全相同，均为 5'-ACGTTACG-3'

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20. 某实验室用RT-qPCR比较样品S和对照C中目标基因X的表达。实验先提取总RNA，逆转录为cDNA，再进行实时荧光定量PCR。已知所有反应扩增效率均为100%，阈值线固定；内参基因在S与C中的Ct相同，而X在S中的Ct比C中的Ct高3个循环。求S中X的初始cDNA拷贝数相对于C的倍数。

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21. 在 CRISPR-Cas9 基因编辑系统中，Cas9 蛋白能够切割特定 DNA 位点，主要依赖以下哪种机制？ A. 向导 RNA 与靶 DNA 互补配对并引导 Cas9 定位　B. Cas9 蛋白自身识别固定 DNA 序列　C. 限制性内切酶识别回文序列　D. DNA 聚合酶在引物引导下延伸

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22. 某学生提取肝细胞总RNA，反转录成cDNA后进行实时定量PCR。内参基因稳定出现Ct约18；目的基因M在两次重复、两组不同引物下均未出现Ct；无模板对照也未出现Ct。据此，最合理的判断是？ A. 反转录反应失败 B. 目的基因M在该肝细胞中未表达或表达低于检测限 C. PCR热循环仪温度程序错误 D. 实时荧光探针发生淬灭

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23. 用Sanger双脱氧链终止法测定一段DNA，在含模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTP及少量ddATP的反应体系中，若链延伸只在掺入ddATP时终止，则所有终止片段的末端碱基均为____（填符号）。

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24. 某实验室欲研究哺乳动物基因X。已知基因X外显子2长600 bp，其内部含有1个EcoRI酶切位点；而外显子2两侧最近的HindIII位点所界定的HindIII片段完整包含该外显子。实验室提取基因组DNA，分别用EcoRI和HindIII完全酶切后电泳转膜，用针对外显子2的标记探针进行Southern杂交；同时提取该动物肝脏总RNA转膜，用同一探针进行Northern杂交。则Southern杂交中EcoRI泳道将出现____条杂交带，HindIII泳道将出现____条杂交带；Northern杂交结果直接反映的是该基因在肝脏中的____（填"拷贝数"或"转录水平"）的差异。

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25. 某实验室以一段双链DNA为模板进行PCR扩增，反应体系初始含目的片段双链分子200个，共循环25次。设扩增效率为90%，即每一循环中各双链模板均以0.9的概率成功完成一次倍增，各分子相互独立。（1）写出循环结束后目的双链分子总数的期望值表达式；（2）计算其数值（保留三位有效数字）。

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26. 某实验室用限制性内切酶BamHI完全酶切某哺乳动物基因组DNA后进行琼脂糖凝胶电泳并转膜，用针对基因Y外显子1的放射性标记探针做Southern杂交。已知基因Y所在的BamHI酶切片段长3.0 kb；另用同一探针对该动物肝脏总RNA进行Northern杂交，检测到的转录本长2.4 kb。若实验中某样品分子全部以单拷贝完整片段或单一种转录本形式存在，计算：(1) Southern杂交中检测到的靶DNA片段与其对应转录本的长度差；(2) 该转录本长度与靶DNA片段长度之比（保留两位小数）。

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